Bakteriofag untuk Pertanian

Singkat kata singkat cerita, sebenarnya kata “Bakteriofag (Bacteriophage)” berasal dari bahasa Yunani (Greek) yaitu Bakteria (Bacteria) dan Phagus (Phagein). Secara umum Bakteriofag merupakan semua jenis virus yang dapat menginfeksi bakteri, yang mana virus ini dapat berkembang dengan memanfaatkan bakteri inangnya.

Sekitar tahun 1917, Ilmuan yang bekerja di Pasteur Institute, Paris berhasil mengidentifikasi keberadaan”makhluk tidak kasat mata” dalam filtrat infeksius sebagai sebuah virus yang menginfeksi bakteri penyebab penyakit Disentri, meskipun sebelumnya Filtrat infeksius serupa telah terdeteksi keberadaan sekitar akhir abad 18 (1896). Dikarenakan sifat dari kespesifikan virus ini yang hanya menginfeksi bakteri, maka virus ini kemudian dikenal dengan Bakteriofag.

Seperti halnya kebanyakan virus, bakteriofag memili komponen/struktur penyusun yang serupa yaitu mantel protein dan asam nukleat. Adapun asam nukleat dari bakteriofag itu sendiri dapat berupa ssDNA, ssRNA, dsDNA, dan dsRNA (ss: untai tungal, ds: untai ganda). Bentuk untaian asam nukleat tersebut umumnya linier, circular maupun segmented.

Asal usul dari bakteriofag itu sendiri masih dalam perdebatan, ada yang mengatakan bahwa bakteriofag berasal dari bakteri itu sendiri yang kemudian bereplikasi secara mandiri, ada yang mengatakan sebagai asal usul plasmid bagi bakteri, bahkan ada yang mengatakan sebagai sebuah virus yang bermutasi sehingga bisa menginfeksi bakteri.

Dilihat dari prilaku bakterifag, beberapa bakteriofag dapat menyisipkan asam nukleatnya dengan asam nukleat bakteri inang (fase lisogenik) dan dapa juga langsung menyebabkan lisisnya bakteri inang dengan menghasilkan beberapa enzim yang berperan dalam pelisisan tersebut. Enzim ini sangat dikenal dengan sebutan “Endolisin”.

Bakteriofag pada bakteri di dunia pertanian telah banyak ditemui khususnya bakteri-bakteri penting dan umum seperti pada Agrobakterium, Pseudomonads, Bacillus, Xylella dan lainnya. Kebanyakan dari bakteriofag diperuntukan bagi keperluan molekuler dan pengendalian hayati. Namun tidak banyak yang mengetahui seberapa penting hubungan interaksi antara bakteriofag terhadap inangnya. Beberapa diantaranya dapat meningkatkan kemampuan bakteri sebagai penyebab penyakit pada tumbuhan, kemampuan bakteri untuk resisten terhadap antibiotik dan bahan kimia tertentu bahkan mungkin di antaranya ada yang menghasilkan toksin yang dapat mempercepat kematian tumbuhan inang seperti halnya pada bakteri hewan dan manusia, Bakteri penyebab diare. Oleh karena itu penting sekali diketahui seberapa besar pengaruh interaksi bakteriofag terhadap bakteri inangnya sebelum kemudian digunakan untuk keperluan molekuler atau pengendalian hayati.

Manfaat Bakteriofag pada dunia pertanian.

Vektor untuk keperluan Kloning molekular. Mungkin telah banyak diketahui bahwa beberapa bakteriofag dapat bermanfaat sebagai alat molekuler paling efektif karena kemampuannya mereplikasi asam nukleatnya secara mandiri. Sebut saja pada “plasmid vektor”. Memang beberapa bakteri secara alami memiliki plasmid yang ukurannya bervariasi mulai dari beberapa ribu basepair bahkan sampai mega basepair. Mengingat dalam kegiatan molekular, penggunaan plasmid vektor sangat penting untuk mempelajari kegunaan gen tertentu contohnya. Sayangnya beberapa bakteri tidak memiliki plasmid yang kompetible (biasanya high copy, ukurannya tidak terlalu besar dan dapat bereplikasi secara mandiri pada sel bakteri inang). Kendala ini ditemui pada bakteri-bakteri dengan ukuran plasmid yang sangat besar seperti pada Ralstonia (hingga mega basepair) atau pada Xanthomonas, sehingga pemetaan plasmid itu sendiri menjadi sulit. Sebuah plasmid dapat dibuat menjadi sebuah vektor jika telah dipetakan berdasarkan urutan asam nukleatnya. Untuk memanipulasi ini, beberapa bakteriofag khususnya dari golongan filamentous phages sangat berguna untuk keperluan ini karena ukurannya yang kecil (5-9 kb). Sebagai contoh vektor yang digunakan adalah Vektor S yang merupakan turunan dari filamentous phage RSS1 pada Ralstonia solanacearum. Namun tidak menutup kemungkinan dari jenis lain seperti Bakteriofag Lambda untuk Erwinia.

Keperluan deteksi keberadaan bakteri tertentu. Untuk hal ini, pemanfaatan bakteriofag dapat diterapkan dengan fungsi utamanya sebagai plasmid ataupun vektor. Dengan sedikit modifikasi asam nukleat pada phage-based vector/plasmid, misalnya dengan menambahkan/menyisipkan gen tertentu yang mempermudah pendeteksian maka hal ini akan sangat berguna sekali. Sebagai contoh dengan menyipkan gen ketahanan terhadap antibiotik atau penghasil warna tertentu (GFP). Beberapa laporan menunjukkan bahwa penggunaan GFP (Green Fluoroscens Protein) sangat efektif untuk melakukan pendeteksian terutama monitoring keberadaan bakteri yang sebelumnya telah ditranformasikan phage-based plasmid yang membawa GFP. Contoh nyata adalah pemanfaatan phage-based plasmid/vector untuk keperluan monitoring pergerakan bakteri Penyebab layu pada Tanaman yang disebabkan oleh R. solanacearum (Pub-1, Pub-2). (Bersambung).

Ketahanan Bakteri terhadap Antibiotik

Ketahanan terhadap antibiotik merupakan salah satu bentuk mekanisme adaptasi mikroorganisme (dalam hal ini bakteri) untuk dapat tetap eksis dan hidup pada lingkungannya dengan keberadaan antibiotik. Ketahanan terhadap antibiotik ini umumnya bersifat heritable (diwariskan dan atau turun temurun) dari sel induk sebelumnya mengingat akan model perkembangan sel bakteri yang umumnya melalui pembelahan binner.

Secara umum, ketahanan bakteri terhadap antibiotik ini diatur oleh gen-gen resistensi terhadap antibiotik yang dimiliki oleh bakteri. Keberadaan gen-gen itu sendiri, umumnya terletak pada plasmid, ada yang bersifat single resistant (Virdis et al., 2010) atau multiresistant atau yang dikenal dengan superbugs (Mehr et al., 2010).

Sebelum mengetahui bagaimana bakteri dapat tahan terhadap antibiotik, maka, perlu diketahui terlebih dahulu bagaimana aksi dari antibiotik terhadap bakteri. Dengan demikian mekanisme ketahanan terhadap antibiotik dapat diketahui melalui reaksi bakteri terhadap aksi antibiotik.

Secara umum, aksi dari antibiotik tergantung dari sifat antibiotik tersebut yang di antaranya:

1.  Menghambat sistesis protein

2.  Menghambat sintesis membran atau dinding sel

3. Penghambat Kompetitor enzim

Dengan 3 aksi dari antibiotik tersebut maka secara garis besar mekanisme ketahanan bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan melalui beberapa cara di antaranya:

1. Menginaktivasi atau memodifikasi antibiotik, sebagai contohnya deaktivasi secara enzimatik  Ceftazidime dengan memproduksi enzim β-lactamase  (Niumsup and Wuthiekanun, 2002).
2. Mengubah target site dari antibiotik. sebagai contohnya,  pengubahan Penicillin Binding Protein (binding target site dari penicillins) padabakteri-bakteri yang tahan terhadap penicillin (Rice et al., 2009).
3. Mengubah jalur metabolis. sebagai contohnya beberapa bakteri yang tahan terhadap sulfonamida tidak membutuhkan para-aminobenzoic acid (PABA), sebuah prekursor penting untuk sintesis asam folat dan asam nukleat di dalam bakteri yang dihambat oleh sulfonamida. Seperti pada sel mamalia, bakteri akan menggunakan pre-asam folat sebagai prekursornya (Feldman, 1967).
4. Mengurangi akumulasi antibiotik dalam sel. Umumnya hal ini dilakukan dengan mengurangi permeabilitas terhadap antibiotik dan atau meningkatkan efflux (pemompaan keluar) antibiotik dari dalam sel melewati permukaan sel (Webber and Piddcock, 2002).

Mekanisme ketahanan terhadap antibiotik

Sumber: (The Science Creative Quarterly)

PUSTAKA

Feldman H. A. 1967. Sulfonamides-resistant meningococci. Annual Review of Medicine 18: 495-506.

Mehr, M. T., H. Khan, T.M. Khan, N.U. Iman, S. Iqbal and S. Adnan. 2010. E. coli urine superbug and its antibiotic sensitivity- a prospective study.  J. Med. Sci. 18(2)110-113.

Niumsup, P.  and V. Wuthiekanun. 2002. Cloning of the class D beta-lactamase gene from Burkholderia pseudomallei and studies on its expression in ceftazidime-susceptible and – resistant strain. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 50:445-455.

Rice, L. B., L. L. Carias, S.Rudin,  R. Hutton,  S. Marshall, M. Hassan, N. Josseaume, L. Dubost, A. Marie and M. Arthur. 2009.  Role of class A penicillin-binding proteins in the expression of beta-lactam resistance in Enterococus faecium. Journal of Bacteriology 191 (11): 3649-3656.

Virdis, S., C. Scarano, F. Cossu, V.Spanu, C. Spanu and E.P.L.De Santis. 2010.  Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococci isolated from goats with subclinical mastitis. Veterinary Medicine International. Doi:10.4061/2010/517060.

Webber M. A and L.J.V. Piddcock. 2002. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51, 9-11

Membuat cDNA

Dalam Central dogma dikatakan bahwa informasi biologi bermula dari DNA ke RNA kemudian ke protein (Gambar 1). Namun, ada juga informasi yang berasal dari RNA ke DNA seperti contohnya pada virus HIV yang hanya memiliki RNA genom yang harus dikonversi dulu menjadi DNA. Untuk mengkonversi RNA menjadi DNA, maka diperlukan enzim yang dikenal dengan reverse transkriptase yang diketahui juga di miliki oleh virus tersebut. Pakar biologi molekular juga berhasil memanfaatkan enzim tersebut, reverse transcriptase, untuk mengkonversi mRNA menjadi complementary DNA (DNA komplementer) yang lebih dikenal dengan cDNA.

Gambar 1. Central dogma: DNA menjadi RNA menjadi mRNA menjadi Protein.

Menggunakan cDNA dalam beberapa kegiatan molekular cenderung lebih aman dibandingkan RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarena kestabilan dari RNA itu sendiri yang mudah sekali terdegradasi oleh RNase. Sehingga untuk berkerja dengan RNA secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi. Oleh karena itu, cara yang dianggap paling efektif dan efisien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya dalam prosesnya menghasilkan cDNA. Begitupula, penyelidikan dengan DNA Microarray juga mengkonversi mRNA menjadi cDNA untuk memproduksi probesnya.

Secara deskripsi, cDNA merupakan untai ganda DNA yang dibuat dari mRNA baik berasal dari prokariot maupun eukariot. Ketika mRNA berhasil diisolasi, maka diperlukan beberapa reagent yang sangat penting dalam proses konversi tersebut yaitu dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase. Selanjutnya yang harus dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan campuran reagen tersebut untuk membuat untai komplemen dari DNA (sintesis untai pertama). Proses ini memakan waktu 10-60 menit tergantung enzim reverse transkriptase yang digunakan. Kemudian mRNA harus dihilangkan dan untai kedua DNA dapat disentesis. Secara umum proses tersebut digambarkan sebagai berikut.

Figure 2. Empat jenis reagen Dasar yang diperlukan untu menghasilkan cDNA: mRNA sebagai cetakan, dNTP, enzim reverse transcriptase dan primer

1. mRNA

mRNA atau yang dikenal dengan messenger RNA merupakan untai tunggal yang membawa kode genetik yang siap untuk ditranslasikan di ribosom menjadi sebuah atau beberapa protein tertentu. Perlu diketahui bahwa tidak semua RNA bisa langsung digunakan sebagai template untuk dibuat sebagai cDNA kaitannya untuk mempelajari ekspresi suatu gen. Sebut saja RNA yang disandikan oleh kelompok eukariot dimana RNA tersebut masih mengandung sekuens asam nukleat yang tidak menyandikan protein tertentu atau yang dikenal dengan intron. Oleh sebab itu intron tersebut perlu dihilangkan sebelum digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA. Sebaliknya sebagian besar RNA dari prokariot bisa langsung digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA karena tidak memiliki intron.

2. dNTPs

dNTPs atau kependekan dari deoksi nucleotida triphosphate merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin dan Timin). Bahan ini sangat penting untuk kelanjutan sintesis cDNA dari mRNA. Tanpa adanya dNTPs maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskri balik dengan bantuan enzim reverse transkriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerisasi menjadi untai cDNA.

3. Enzim Reverse Transcriptase

Enzim reverse transkriptase merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Di alam, banyak sekali jenis enzim ini yang secara umum dimiliki oleh virus-virus yang memiliki asam nukleat berupa RNA seperti HIV. Adapun enzim reverse transkriptase yang banyak digunakan untuk membuat cDNA di antaranya adalah M-MLV reverse transkriptase dari Moloney murine leukemia virus dan AMV reverse transkriptase dari avian myeloblastosis virus. Enzim ini akan bekerja dari ujung 3′ ke ujung 5′ dari mRNA.
4. Primer.

Terdapat tiga jenis primer yang dapat digunakan untuk mensintesis cDNA. 1) Jika mRNA memiliki poly-A pada ujung 3′, maka primer oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukariot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3′ setelah proses splicing untuk menghilangkan intron.
2) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari mRNA tertentu (mRNA target) maka penggunaan primer spesifik dapat dilakukan. Primer jenis umumnya digunakan pada mRNA dari sel prokariot karena mRNA dari sel prokariot tidak mengandung poly-A (sel tidak melakukan poly adenilasi.
3) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari seluruh mRNA secara acak, maka random primer dapat digunakan.
Namun, pemilihan primer secara umum adalah tergantung pada jenis kebutuhan dan target mRNA yang digunakan.

NUKLEASE



Dalam melakukan purifikasi protein dan asam nukleat spesifik terkadang membutuhkan digesti dari DNA, RNA atau keduanya. Masalah viskositas yang dihasilkan karena tingginya konsentrasi DNA dan metoda disosiasi enzimatik sel terkadang menunjukkan adanya peranan DNase.

Adapun beberapa DNase yang sering digunakan, di antaranya:

1. Benzonase®

Merupakan endonuklease, rekombinan dari Serratia marcescens yang diekspresikan oleh E.coli. Enzim ini menghidrolisa untai ganda maupun tunggal DNA dan RNA yang menghasilkan produk ujung 5′-fosfomononukleotida dan 5′-fosfooligonukleotida. Temperatur optimum dari enzim ini adalah 37°C dengan kisaran operasi 0-40°C. Enzim ini aktif bersamaan dengan adanya deterjen ionik dan non-ionik, agen reduksi dan urea.

Enzim ini digunakan untuk menghilangkan asam nukleat dari sampel protein dan untuk menurunkan viskositas karena asam nukleat.

Gambar 1. Mode of Action dari Benzonase

2. Deoxyribonuclease I atau Dnase I

Deoksiribonuklease I atau DNase I berasal dari pankreas Bovine. Enzim ini mengkatalis endonukleolitik untai ganda maupun tunggal DNA dengan produk ujung 5′-fosfonukleotida dan 5′-fosfooligonukleotida dalam bentuk campuran yang komplekx. Adanya ion magnesium (mg), DNase I bereaksi dengan masing-masing untai DNA secara terpisah pada lokasi yang acak. Selain itu, keberadaan manganese(II) menyebabkan DNase I bereaksi pada kedua untai hampir pada tempat yang sama.

Kebanyakan protokol menggunakan ion magnesium dengan DNase I, namun untuk tujuan tertentu, kebanyakan menggunakan manganese.

Enzim ini memiliki berat molekul 30,072 yang dihitung dari sekuennya. Secara struktural, enzim ini berbentuk polipeptida tunggal yang tersusun atas dua jembatan disulfida dan satu karbohidrat dari monosakarida. pH optimum bagi aktivitas enzimatiknya berkisar 7-8, namun DNase yang bebas protease ini stabil pada kisaran pH 5-7 pada suhu 60 °C hingga 5 jam, lebih spesifik lagi pada suhu °C, 1 mg/mL larutan akan kehilangan aktivitasnya sebanyak 6%perjam baik pada buffer asetat (pH5) atau pada buffer Tris pH 7.2. Aktivitas enzim akan rusak pada suhu 68 °C.

Gambar 2. Mode of Action DNase I

3. Deoxyribonuclease II (DNase II)

Deoksiribosanuklease II atau DNase II merupakan enzim yang mengkatalis reaksi endonukleolitik untai ganda maupun untai tunggal DNA menjadi nukleotida unjung 3′-fosfat dan 3′-fosfatoligonukleotida. Enzim ini memiliki berat molekul sekitar 38,000 Dalton dengan aktivitas pada kisaran pH antara 4.0 sampai 6.5, namun pada pH 6.5, hanya sekitar 15% enzim yang bereaksi. Namun secara keseluruhan, aktivitas enzim ini sangat baik (optimum) pada pH 5.0.

Stabilitas aktivitas enzim secara optimum dapat terjadi pada kondisi pH antara 5 – 5.5, dan dapat diinaktifkan dengan cepat pada pH 8.5 dan suhu 30 °C.

Gambar 3. Mode of Action DNase II

4. Eksonuklease III

Enzim ini mengkatalis reaksi eksonukleolitik pada ujung 3′- ke arah ujung 5′- menjadi nukleotida 5′-fosfat. Enzim ini sangat efektif pada untai ganda DNA dan kemungkinan bersar dapat menghambat aktivitas endonukleolitik DNA pada lokasi APURINIK (apurinic = lokasi dimana tidak terdapat basa purin (Adenin dan Guanin).

Gambar 4. Mode of Action Eksonuklease II

5. Nuklease S₁

Enzim nuklease S1 berasal dari Aspergillus oryzae merupakan enzim yang mengkatalis reaksi
Catalyzes the nonspecific endo- and exonucleolytic cleavage of single stranded DNA and RNA to yield nucleoside 5′-phosphates and 5′-phosphooligonucleotides. It is used to digest non-annealed polynucleotide tails and hairpin loops in RNA and DNA duplexes and can be used to convert super-helical DNA to the linear form.

Molecular weight: approximately 34 kDa and exists as a monomer.
The optimal pH range is 4.0 to 4.6 and it is activated by Zn²⁺ and/or Ca²⁺ ions. It is inhibited by chelators, such as EDTA and citrate, and by high concentrations of SDS.

Nuclease S₁ may exhibit some nickase activity at high concentrations. This nickase activity can be inhibited by including a high concentration of NaCl (approximately 200 mM) in the reaction buffer.

RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan variasi dari polymerase chain reaction (PCR), sebuat teknik laboratorium yang biasanya digunakan dalam biologi molekular untuk menghasilkan sejumlah gandaan bagian tertentu untai DNA atau yang dikenal dengan Amplifikasi. Dalam RT-PCR, sebaliknya, untai RNA pertama-tama di transkrip balik menjadi DNA komplemen (complementary DNA, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transcriptase, dan cDNA yang dihasilkan akan digandakan sepertihalnya PCR pada umumnya. Reverse transcription PCR (RT-PCR) jangan dirancukan dengan Real-Time Polymerase Chain Reaction (Q-PCR/qRT-PCR), yang biasanya terjadi kesalahan dalam penggunaan singkatan. Jadi RT-PCR merupakan singkatan dari Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction dan bukan kependekan dari Real-Time PCR. Biasanya Real-Time PCR disingkat dengan Q-PCR atau qPCR atau yang sebenarnya adalah Quantitative PCR.

Prinsip dan Prosedur RT-PCR

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti amplifikasi logaritmik.

RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik dimana RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan.

Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA at 95°C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu anealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation.

Perhatian utama saat memilih temperatur anealing optimal adalah melting temperatur ™ dari primer dan probe (jika digunakan). Temperatur annealing dipilih untuk PCR tergantung langsung pada panjang dan komposisi dari primer tersebut. Hal ini merupakan hasil dari perbedaan ikatan hidrokarbon antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3 ikatan). Temperatur annealing biasanyaberkisar 5 derajat di bawah Tm terendah dari pasangan primer yang digunakan.

Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler. Analaisa produk PCR tergantung pada kebutuhann PCR. Jika menggunakan PCR konvensional, maka produk PCR dapat dideteksi dengan agarose gel electrophoresis dan ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).

TRANSPOSON

Transposons merupakan sekuen DNA yang dapat berpindah dari satu tempat ke tempat yang lain dalam genom sebuah sel. Perpindahan ini sering juga disebut dengan Transposisi. Pada prosesnya, transposisi ini dapat menyebabkan mutasi dan perubahan ukuran dari DNA genom. Transposon juga biasa disebut sebagai “gen loncat” atau jumping genes, dan merupakan salah satu contoh dari elemen genetik bergerak (Mobile Genetic Elements). Transposon ditemukan oleh Barbara McClintock pada permulaan karirnya dan berhasil mendapatkan Penghargaan Nobel pada tahun 1983.

Terdapat bermacam-macam elemen genetik bergerak, dan dapat dikelompokkan berdasarkan mekanisme transposisinya.
1.Klas I, atau disebut juga dengan retrotransposons, dalam class ini elemen genetik bergerak ini menggandakan dirinya dengan mentraskrip RNA, kemudian di transkrip kembali menjadi DNA dengan bantuan enzim reverse transcriptase, selanjutnya menyisip pada bagian lain di Genom.
2.Klas II merupakan elemen genetik bergerak yang berpindah secara langsung dari satu posisi ke posisi yang lain dengan bantuan enzim transposase untuk memotong dan meletakkan hasil potongan tersebut di bagian lain dari Genom.



Transposon membuat potongan besar dari ukuran genom yang dibuktikan dengan nilai C (Sitosin) dari spesies eukariot.  Pada mulanya elemen ini diduga sebagai fragmen yang tidak berguna atau disebut juga Junk DNA, hingga akhirnya diketahui bahwa elemen tersebut ternyata memiliki peranan penting dalam perkembangan organisme.

Tipe-tipe Transposon
Transposons diklasifikasikan menjadi dua Klas berdasarkan mekanisme transposisinya:
Class I: Retrotransposons
Retrotransposons bekerja dengan cara menggandakan dirinya kemudian meletakkan hasil gandaan tersebut kembali pada beberapa tempat di genom. Permulaan retrotransposon diawali dengan menggandakan untaian DNA melalui transkripsi RNA, selanjutnya RNA ditranskrip kembali menjadi DNA dengan bantuan enzim reverse transkriptase (yang biasanya disandikan sendiri) dan kemudian menyipiknyan pada genom.

Retrotransposons ini mirip dengan retroviruses, seperti HIV, yang mungkin sekali erat kaitannya dengan asal-usul dan evolusi virus..
Pada Klas I ini masih dibagi lagi menjadi 3 Klas:
Viral: menyandikan reverse transcriptase (untuk transkrip balik RNA menjadi DNA), memiliki long terminal repeats (LTRs), mirip dengan retroviruses
LINEs: menyandikan reverse transcriptase, tidak LTRs, ditranskripsi oleh RNA polymerase II
Nonviral superfamily: tidak mengkode reverse transcriptase, ditranskrip oleh RNA polymerase III

Class II: DNA transposons
Perbedaan utama dari Class II transposon dengan Retrotransposon adalah mekanisme transposisinya yang tidak melibatkan transkripsi RNA (RNA intermediate). Class II transposons biasanya berpindah melalui mekanisme yang dianalogikan dengan “cut dan paste”, daripada “copy dan paste”, yang menggunakan enzim transposase. Tipe transposase yang berbeda akan berbeda pula mekanismenya. Beberapa dapat mengikat pada bagian molekul DNA, dengan site target yang acak, sedangkan tipe yang lain mengikat secara spesifik pada sekuens tertentu. Transposase membuat potongan sticky ends, melepaskan transposon dari genom dan melekatkannya pada site target. Sebuah DNA polimerase mengisi gap yang terbentuk dari potongan sticky ends dan DNA ligase menutup untaian sugar-phosphate.
Tidak semua enzim transpose melalui mekanisme cut dan paste. Pada beberapa kasus seperti replicative transposition juga dapat terjadi dimana transposon mereplikasi dirinya untuk site target yang baru.

Transposons yang hanya berpindah melalui mekanisme cut dan paste kemungkinan juga menggandakan dirinya jikan transposisi terjadi selama Fase S dari siklus sel dimana ketika donor telah tereplikasi tetapi site targetnya belum tereplikasi.

Kedua Klas transposon tersebut kemungkinan dapat kehilangan kemampuan mensintesis enzim reverse transkriptase maupun transposase melalui mutasi, namun ada juga yang tetap melakukan transposisi karena elemen transposon lain masih aktif (sharing enzyme usage).

Retroviruses sebagai elemen transposable
Retroviruses pertama kali diidentifikasi 80 tahun yang lalu sebagai agen yang terlibat dalam kejadian penyakit Kanker. Informasi terkini menyatakan bahwa epidemi AIDS terjadi akibat HIV retrovirus. Pada permulaan 1970an, ditemukan retrovirus yang memiliki kemampuan menggandakan RNA genomnya dengan mengkonversi RNA menjadi DNA yang lebih stabil dalam mengintegrasi dengan DNA inangnya. Hal ini hanya merupakan perbandingan bahwa retrovirus telah dikenal sebagai bentukan khusus dari transposon eukariot. Pengaruhnya sebagai transposon yang berpindah melalui intermediet RNA biasanya meninggalkan sel inangnya dan menginfeksi sel yang lain. Bentukan DNA terintegrasi (provirus) dari retrovirus menunjukkan kesamaannya dengan ciri-ciri transposon.

Siklus transposisi dari retrovirus memiliki kesamaan lain dengan transposon prokariot, yang menujukkan adanya hubungan kekerabatan antara kedua tipe transposon ini. Fase penting dalam transposisi retrovirus adalah molekul DNA extrachromosomal DNA. Ini terjadi melalui penggandaan RNA dari partikel virus menjadi DNA melalui polimerase yang disandikan oleh retrovirus atau yang disebut kenal dengan reverse transcriptase.

Transposons menyebabkan penyakit
Transposons merupakan mutagen. Transposon dapat merusak genom dari sel inangnya melalui beberapa cara:
A transposon atau retroposon menyisip pada fungsional gen dan menyebabkan gen tersebut tidak berfungsi.
Setelah transposon meninggalkan gen, akan menyebabkan terbentuknya gap, yang selanjutnya kemungkinan gap tersebut tidak diperbaiki dengan tepat.
Beberapa gandaan dari sekuen yang sama, seperti sekuen Alu dapat menghambat keakuratan pembentukan pasangan DNA kromosom selalam mitosis dan meiosis, menyebabkan terjadinya ketidak identikan pasangan kromosom.
Penyakit yang biasanya disebabkan oleh transposon meliputi hemofilia A dan B, beberapa immunodeficiency, porphyria, predisposition kanker dan Duchenne muscular dystrophy.

Bahkan, beberapa transposon mengandung promotor yang yang melakukan transkripsi dari transposase. Promotor tersebut dapat menyebabkan terjadinya penyimpangan ekspresi gen terkait dan menyebabkan suatu penyakit atau mutant fenotip.

Kejadian transposisi, induksi dan pertahanan
Satu kajian menduga kejadian transposisi dari retrotransposon, elemen Ty1 dari Saccharomyces cerevisiae. Menggunakan beberapa asumsi, bahwa kejadian transposisi terjadi setiap satu elemen Ty1 dapat terjadi setiap beberapa bulan hingga beberapa tahun sekali.
Pertahanan sel terhadap proliferasi dari elemen transposon dapat dilakukan dengan beberapa cara yang melibatkan piRNAs dan siRNAs yang dapat meredam aktifitas transposable setelah ditranskripsi.
Beberapa elemen transposable mengandung promotor yang bersifat heat-shock dan kecepatan transposisinya meningkat jika sel dalam kondisi stress, sehingga kecepatan mutasinya pun meningkat pada kondisi tersebut.

Evolusi transposon
Transposon ditemukan dalam seluruh ranting kehidupan. Sementara transposon dapat memberi manfaat pada sel inang, meskipun secara umum dianggap sebagai parasit yang hidup di dalam genom sel organisme. Dengan cara ini, mereka mirip dengan virus. Virus dan transposon juga berbagi fitur dalam struktur genom dan kemampuan biokimia, yang menyebabkan spekulasi bahwa mereka berbagi moyang bersama.

Ketika aktivitas transposon menyebabkan terjadinya kerusakan genom, beberapa organisme nampaknya telah mengembangkan mekanisme untuk menekan terjadinya transposisi pada tingkat yang bisa dikendalikan. Bakteri kemungkinan melakukan penghapusan gen sebagai bagian dari mekanime menghilangkan transposon dan virus dari genom, sedangkan pada pada organisme eukariot kemungkinan akan mengembangkan mekanisme RNA interference (RNAi) sebagai suatu cara untuk menekan aktivitas transposon.

Interspersed Repeats dalam genom dibuat melalui akumulasi transposisi yang terjadi selama masa waktu tertentu. Interspersed Repeats menghalangi konversi gen yang selanjutnya mempercepat terbentuknya gen baru. Oleh karena itu transposon merupakan perangkat evolusi dari gen baru dan melindungi sekuen gen dari penimpaan oleh sekuens gen serupa melalui konversi gen.

Aplikasi
Transposon pertama ditemukan pada tanaman jagung (Zea mays) dan dinamakan dissociator (Ds). Begitupula, transposon pertama dalam bidang molekular pertama kali diisolasi dari tanaman (Snapdragon). Lebih tepatnya, transposon telah secara khusus sangat berguna sebagai alat dalam teknologi biologi molekular tanaman. Para peneliti menggunakan transposon untuk tujuan mutagenesis. Pada konteks ini, sebuat transposon menyisip pada gen dan menghasilkan mutasi. Keberadaan transposon memfasilitasi kegiatan-kegiatan molekular seperti identifikasi mutan allel, misalnya.

Kadang-kadang penyisipan transposon pada gen dapat mengganggu aktivitas dan fungsi gen pada kondisi yang mungkin dapat kembali normal melalui aktivitas enzim transposase yang mengeluarkan transposon dari gen dapat mengembalikan fungsi gen. Hal ini menghasilkan tanaman dengan sel tetangganya memiliki genotipe yang berbeda. Karakteristik ini memberikan jalan bagi peneliti untuk dapat membedakan antara gen yang harus ada dalam sel dalam kaitannya dengan fungsinya (cell-autonomous) dan gen yang menghasilkan pengaruh yang dapat diamati dalam sel dari pada sekedar ekspresi gen.
Transposons juga digunakan secara umum sebagai alat untuk mutagenesisi pada kebanyakan percobaan penelusuran organisme.

DNA (DEOXIRIBO NUCLEIC ACID)

Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.

Secara umum,  DNA sangat penting bagi sebuah sel karena berperan sebagai materi genetik; dimana DNA menyimpan cetak biru (Blue print) bagi segala aktivitas sel kecuali pada  beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme).

Karakteristik kimia

DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida.

Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida 3,3 Å^[1]. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia terdiri atas 220 juta nukleotida^[2].

 

Gambar 1. Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai ganda.

Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa.

DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin (dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin.

Fungsi biologis

Replikasi

 

Gambar 2. Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan.

Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akan membelah diri. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari dua rantai dan rantai yang satu merupakan “konjugat” dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk. Ada beberapa teori yang mencoba menjelaskan bagaimana proses replikasi DNA ini terjadi. Salah satu teori yang paling populer menyatakan bahwa pada masing-masing DNA baru yang diperoleh pada akhir proses replikasi; satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai “cetakan” untuk membuat rantai pasangannya.

Proses replikasi memerlukan protein atau enzim pembantu; salah satu yang terpenting dikenal dengan nama DNA polimerase, yang merupakan enzim pembantu pembentukan rantai DNA baru yang merupakan suatu polimer. Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA. Proses pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh beberapa jenis protein yang dapat mengenali titik-titik tersebut, dan juga protein yang mampu membuka pilinan rantai DNA. Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh rantai telah benar-benar terpisah.

Proses replikasi DNA ini merupakan proses yang rumit namun teliti. Proses sintesis rantai DNA baru memiliki suatu mekanisme yang mencegah terjadinya kesalahan pemasukan monomer yang dapat berakibat fatal. Karena mekanisme inilah kemungkinan terjadinya kesalahan sintesis amatlah kecil.

Penggunaan DNA dalam teknologi

DNA dalam forensik

Ilmuwan forensik dapat menggunakan DNA yang terletak dalam darah, semen, kulit, liur atau rambut yang tersisa di tempat kejadian kejahatan untuk mengidentifikasi kemungkinan tersangka, sebuah proses yang disebut fingerprinting genetika atau pemrofilan DNA (DNA profiling). Dalam pemrofilan DNA panjang relatif dari bagian DNA yang berulang seperti short tandem repeats dan minisatelit, dibandingkan. Pemrofilan DNA dikembangkan pada 1984 oleh genetikawan Inggris Alec Jeffreys dari Universitas Leicester, dan pertama kali digunakan untuk mendakwa Colin Pitchfork pada 1988 dalam kasus pembunuhan Enderby di Leicestershire, Inggris. Banyak yurisdiksi membutuhkan terdakwa dari kejahatan tertentu untuk menyediakan sebuah contoh DNA untuk dimasukkan ke dalam database komputer. Hal ini telah membantu investigator menyelesaikan kasus lama di mana pelanggar tidak diketahui dan hanya contoh DNA yang diperoleh dari tempat kejadian (terutama dalam kasus perkosaan antar orang tak dikenal). Metode ini adalah salah satu teknik paling terpercaya untuk mengidentifikasi seorang pelaku kejahatan, tetapi tidak selalu sempurna, misalnya bila tidak ada DNA yang dapat diperoleh, atau bila tempat kejadian terkontaminasi oleh DNA dari banyak orang.

DNA dalam komputasi

DNA memainkan peran penting dalam ilmu komputer, baik sebagai masalah riset dan sebagai sebuah cara komputasi.

Riset dalam algoritma pencarian string, yang menemukan kejadian dari urutan huruf di dalam urutan huruf yang lebih besar, dimotivasi sebagian oleh riset DNA, dimana algoritma ini digunakan untuk mencari urutan tertentu dari nukleotida dalam sebuah urutan yang besar. Dalam aplikasi lainnya seperti editor text, bahkan algoritma sederhana untuk maslah ini biasanya mencukupi, tetapi urutan DNA menyebabkan algoritma-algoritma ini untuk menunjukkan sifat kasus-mendekati-terburuk dikarenakan jumlah kecil dari karakter yang berbeda.

Teori database juga telah dipengaruhi oleh riset DNA, yang memiliki masalah khusus untuk menaruh dan memanipulasi urutan DNA. Database yang dikhususkan untuk riset DNA disebut database genomik, dam harus menangani sejumlah tantangan teknis yang unik yang dihubungkan dengan operasi pembandingan kira-kira, pembandingan urutan, mencari pola yang berulang, dan pencarian homologi.

Sejarah

DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwan Swiss Friedrich Miescher di Tubingen, Jerman, yang menamainya nuclein berdasarkan lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap peranan DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan ditemukannya postulat genetika Mendel. DNA dan protein dianggap dua molekul yang paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori tersebut.

Gambar 3. Friedrich Miescher

Dua eksperimen pada dekade 40-an membuktikan fungsi DNA sebagai materi genetik. Dalam penelitian oleh Avery dan rekan-rekannya, ekstrak dari sel bakteri yang satu gagal men-transform sel bakteri lainnya kecuali jika DNA dalam ekstrak dibiarkan utuh. Eksperimen yang dilakukan Hershey dan Chase membuktikan hal yang sama dengan menggunakan pencari jejak radioaktif (radioactive tracers).

Misteri yang belum terpecahkan ketika itu adalah: bagaimanakah struktur DNA sehingga ia mampu bertugas sebagai materi genetik? Persoalan ini dijawab oleh Francis Crick dan koleganya James Watson berdasarkan hasil difraksi sinar-x DNA oleh Maurice Wilkins dan Rosalind Franklin. Crick, Watson, dan Wilkins mendapatkan hadiah Nobel Kedokteran pada 1962 atas penemuan ini. Franklin, karena sudah wafat pada waktu itu, tidak dapat dianugerahi hadiah ini.

Konfirmasi akhir mekanisme replikasi DNA dilakukan lewat percobaan Meselson-Stahl yang dilakukan tahun 1958.

 

(Sumber asli diambil dari Wikipedia dengan sedikit modifikasi dan penambahan video).

ESI-MS (ELECTROSPRAY IONIZATION-MASS SPECTROMETRY)

Electrospray ionization (ESI) merupakan teknik yang digunakan dalam mass spectrometri untuk menghasilkan ion. Khususnya untuk menghasilkan ion dari makromolekul karena ada kecenderungan molekul tersebut menjadi fragment saat diionisasi. Pengembangan electrospray ionization untuk analisa makromolekul biologi merupakan sebuah kerja keras jadi John Bennet Fenn pada tahun 2002 dan memperoleh sebuah Nobel dibidang Kimia. Satu dari instrumen asli yang digunakan oleh Dr. Fenn saat ini di pajang di Chemical Heritage Foundation in Philadelphia, Pennsylvania.

Mass spectrometry yang menggunakan teknologi ESI disebut dengan electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) atau juga dengan sebutan electrospray mass spectrometry (ES-MS).

Teori dan Sejarah
Fenomena electrospray telah diketahui ratusan tahun yang lalu, tapi hingga permulaan abad ke 20, masih belum ada pengetahuan yang signifikan tentang fenomena ini. Hingga pada 30 tahun yang lalu, percobaan yang dilakukan oleh Malcom Dole dan kawan-kawan berhasil mendemonstrasikan penggunaan electrospray untuk mengioninasi senyawa kimia hingga dan teknik electrospray ionisation (ESI) inipun ditemukan. 20 tahun berlalu hingga pada akhirnya Laboratorium dimana John Fenn bekerja, berhasil mendemonstrasikan untuk pertama kalinya penggunaan ESI untuk ionisasi senyawa biologi dan analisanya dengan mass spectrometri. Hasil upaya ini membuahkan hasil sebuah Nobel pada tahun 2002 dibidang kimia yang juga merupakan Nobel ke-4 yang diberikan atas upaya pengembangan dibidang mass spectrometri. Pada publikasi asil sekitar akhir 1980-an, Fenn dan teman-temanya berhasil mendemonstrasikan prinsip dan metodologi eksperimen dasar dari teknik ESI yang meliputi soft ionisation dari senyawa involatil dan termolabil, protein dengan banyak muatan ionisasi kompleks. ESI-MS saat ini merupakan alat dasat yang dingunakan hampir di seluruh laboratorium biokimia di dunia.

Gambar 1. ESI

Alat ESI terus dikembangkankan tapi secara umum susunan dari komponen dasarnya sama (Gambar). Analit dimasukan dalam larutan dari jarum pompa atau aliran eluen dari liquid chromatography. Kecepatan aliran yang biasa digunakan adalah 1µl min^-1. Selanjutnya analit mengalir melewati jarum electrospray yang memiliki tegangan tinggi yang berbeda (berasal dari counter electrode) (biasanya berkisar 2.5 sampai 4 kV). Ini meningkatkan semprotan dari tetesan sampel yang bermuatan ion dari jarum pada permukaan yang juga bermuatan dan berpolaritas sama dengan muatan pada jarum. Tetesan dikeluarkan dari jarum menuju alat sumber sampel yang berupa kerucut pada kotak elektroda (Warna biru). Selanjutnya tetesan sampel tersebut akan melewati ruang di antara jarum dan kerucut dan selanjutnya pelarut sampel akan terevaporasi.

Gambar. 2: Skema ESI

Ketika solvent (pelarut) terevaporasi, maka tetesan akan menguap hingga batas tegangan permukaan (the Rayleigh limit) dimana “Coulombic explosion” terjadi dan tetesan menjadi bagian-bagian (serpihan). Hal ini akan menghasilkan tetesan-tetesan kecil yang dapat diulang terus menerus hingga menghasilkan analit (tanpa pelarut) yang telah bermuatan ion. Molekul yang bermuatan ini dapat berupa molekul yang bermuatan ion tunggal ataupun bermuatan ion lebih dari satu. Cara ini merupakan metode paling murni dalam ionisasi dimana sangat kecil sekali residu energi yang tersisa dari analit ketika ionisasi. Oleh karena itu mengapa ESI-MS merupakan teknik penting dalam kajian biologis dimana analit yang diperlukan biasanya berupa molekul-protein non-kovalen atau protein-protein interaction secara tidak langsung ditransfer ke fase gas. Kelemahan utama dari teknik ini adalah sangat kecilnya (biasanya tidak ada) terjadinya fermentasi.

Gambar 3. Skema pembentukan ion pada analit dengan ESI-MS

Satu dari permasalahan utama pada analisa protein dengan mass spectal (and makromolekul lainnya) dan selalu muncul adalah massa yang berada diluar range massa mass spektrometer pada umumnya. Sebelum dikembangkan ESI, hanya ada satu cara metode ionisasi yang dilakukan yaitu dengan melakukan analisa sampel dengan fast atom bombardment (FAB). Tapi teknik ini menghasilkan predominansi dari muatan ion tunggal dan yang paling baik adalah beberapa muatan ion pada kisaran instrumen yang mencapai m/z 8 kDa. Hanya cara tersebut yang dapat dilakukan untuk mendigesti protein dan menganalisa campuran tersebut. Meskipun digesti protein masih merupakan teknik yang penting dalam mass spektrometri, hal ini menjadi relatif lebih mudah untuk mendapatkan secara langsung mass protein yang akan diukur dengan ESI-MS. Muatan beberapa ion secara statistik terdistribusi pada sisi-sisi dasar protein. Gambar berikut menunjukkan karakteristik analisa dengan ESI mass spectrum pada sampel myoglobin hati kuda (16.9 kDa). Puncak teramanai merupakan hasil adanya pengaruh dari muatan-muatan ion, pada kasus ini muatan adalah roughly Gaussian yang terdistribusi rata-rata +15 muatan dengan kisaran +22 hingga +10. Distribusi aktual dari muatan ion ini tergantung pada sejumlah faktor, tapi umumnya kondisi elektrospray memiliki pengaruh yang sangat besar pada distribusi muatan ion sebagaimana halnya struktur dari protein.

Sebuah tutorial yang cukup baik pada aplikasi ESIMS untuk ilmu biologi dan biokimia telah dipublikasikan oleh Komunitas Biokimia. Sedangkan untuk level tinggi (Graduate Student) dipublikasi oleh Simon Gaskell pada tahun 1997.

Daftar Pustaka

[1] S. Chapman; Physical Review, 10; 1937; p184.

[2] M. Dole et al.; Journal of Chemical Physics, 49; 1968, p2240 and Journal of Chemical Physics, 50; 1970, p4977.

[3] J.B. Fenn et al.; Journal of Physical Chemistry, 88; 1984, p4451 and Zeitschrift für Physik D, 10; 1988, p361 and Science, 246; 1989, p64.

[4] J.B. Fenn; Agewandte Chemie – International Edition, 42; 2003, p3871.

[5] B.N.Pramanik, A.K. Ganguly and M.L. Gross; Applied Electrospray Mass Spectrometry – Volume 32 of the Practical Spectroscopy Series. Pub. Marcel Dekker, New York, 2002, ISBN: 0-8274-0618-8.

[6]W. J. Griffiths et al.; Biochemical Journal, 355; 2001, p545.

[7] S.J.Gaskell; Journal of Mass Spectrometry, 32, 1997, p677.

cDNA

DNA Komplementer

Pada bidang genetika, complementary DNA (cDNA) merupakan DNA yang disintesis dari template mRNA dalam sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim reverse transcriptase. cDNA biasanya digunakan untuk kloning gen eukariot dalam prokariot. Jika seorang ilmuan ingin mengekspresikan protein tertentu dalam sell yang secara normalnya tidak mengekspresikan protein tersebut (contohnya ekspresi heterolog), mereka akan mentranfer cDNA yang mengkode protein tersebut ke dalam sel donor (sel penerima). cDNA juga diproduksi oleh kelompok retrovirus (seperti HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus, dan lain sebagainya) yang terintegrasi dengan inangnya untuk membuat sebuah provirus (calon virus).

Pendahuluan

Central dogma dari biologi molekular mengatakan bahwa dalam sintesis protein, DNA pertama-tama di transkrip menjadi mRNA yang selanjutnya akan mentranslasikan protein. Satu perbedaan antara gen eukariot dan prokariot adalah adanya intron (intervening sequence) pada gen eukariot, yang juga bukan merupakan sequens penyandi, dan harus dihilangkan (splice) dari RNA sebelum menjadi mRNA dan kemudian dapat ditranslasi menjadi protein. Sedangkan gene prokariot tidak memiliki intron, sehingga RNA bakteri tidak melakukan penghilangan intron (splicing).

Biasanya, keperluan ekpresi gen eukariot dilakukan dalam sel prokariot. Metode yang sangat sederhara untuk melakukan hal ini adalah menambahkan DNA eukariot ke dalam sel donor prokariot, yang kemudian akan mentraskripkan DNA menjadi mRNA dan kemudian mentranslasikan protein. Sayangnya, DNA protein memiliki intron, dan juga sel prokariot tidak memiliki kemampuan untuk melakukan splicing, sehingga untuk melakukan hal ini splicing harus dilakukan sebelum DNA eukariot tersebut dimasukan ke dalam sel prokariot. DNA yang telah dibuat merupakan komplemen dari RNA yang juga disebut complementary DNA (cDNA). Untuk mengekspresikan protein dari cDNA tersebut, maka diperlukan sequence pengatur ekspresi seperti Promotor.

Sintesis

Terdapat beberapa metode yang dapat dilakukan, cDNA harus di sintesis dari mRNA (setelah splicing atau mRNA tanpa Intron) menggunakan enzyme reverse transcriptase. Enzim ini bekerja pada untai tunggal mRNA, menghasilkan DNA komplemen berdasarkan urutan pasang basa RNA (A, U, G dan C) menjadi DNA komplemen (T, A, C dan G berturut-turut).

Untuk mendapatkan cDNA dari sel eukariot yang intronnya telah dihilangkan (spliced) sebagai berikut:

1. Sel eukariot mentranskripkan DNA (dari gen) menjadi RNA (pre-mRNA)
2. Sel yang sama kemudian melakukan proses splicing pada untai pre-mRNA, dan menambahkan ujung poly-A tail dan 5’ Methyl-Guanine cap.
3. Campuran untai mRNA diekstrak dari sel
4. Sebuah primer oligonukleotida poly-T berhibridisasi dengan poly-A tail dari templet mRNA, atau primer hexamer acak dapat ditambahkan yang mana mengandung 6 basa yang paling mungkin ada dalam untai DNA dan dapat berhibridisasi di mana saja dalam RNA (dipelukan reverse transcriptase)
5. Penambahan Reverse transcriptase, dan juga deoxynucleoside triphosphates (A, T, G, C).

Enzim reverse transcriptase akan mengecek mRNA dan mensinstesi sebuah DNA yang merupakan pasangan dari mRNA tersebut. Untaian inilah yang disebut cDNA.

Berikut adalah animasi dari siklus virus HIV yang diantaranya adalah mensintensis cDNA dalam inangnya.

SIKLUS PCR

PCR atau Polymerase Chain Reaction

Parameter amplifikasi tergantung pada template, primer dan aparatus amplifikasi yang digunakan..

Tahap Denaturasi Awal

• Denaturasi sempurna template DNA pada permulaan PCR merupakan salah satu hal penentu suksesnya reaksi PCR. Tidak sempurnanya denaturasi DNA menyebabkan penggunaan template yang tidak efisien pada permulaan siklus amplifikasi dan hasil PCR yang kurang baik. Denaturasi awal harus dilakukan sekitar 1-3 menit pada suhu 95°C jika kandungan GC dari DNA target adalah 50% atau less. Interval ini dapat ditingkatkan hingga10 menit jika kandungan GC dari DNA templet sangat tinggi.
• Jika denaturasi awal kurang dari 3 menit pada suhu 95°C, Taq DNA Polymerase dapat ditambahkan pada campuran saat reaksi awal. Jika waktu denaturasi awal yang diperlukan sangat lama atau suhu yang digunakan sangat tinggi, maka Taq DNA Polymerase harus ditambahkan setelah denaturasi awal untuk menjaga stabilitas enzim yang secara drastis turun pada suhu lebih dari 95°C.

Tahap Denaturasi.

Biasanya denaturasi selama 0.5 – 2 menit pada suhu 94-95°C sudah cukup baik, ketika produk PCR yang disintesis pada siklus amplifikasi awal cukup pendek dari pada templet DNA dan telah terdenaturasi secara sempurna pada kondisi tersebut. Jika DNA yang diamplifikasi memiliki kandungan GC yang cukup tinggi, waktu denaturasi sebaiknya ditingkatkan mecapai 3-4 menit. Selain itu penambahan bahan untuk membantu proses denaturasi dapat dilakukan misalnya dengan gliserol (hingga 10-15 %), DMSO (hingga 10%) atau formamid (hingga 5%). Dengan adanya bahan tersebut, temperatur anealing harus diatur secara experimental, mengingat Tm dari primer-templat menurun secara signifikan ketika bahan-bahan tersebut digunakan. Jumlah enzim dalam reaksi harus ditingkatkan hingga 50%, mengingat DMSO dan formamid, pada konsentrasi tersebut menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase. Selain itu, ada cara umum yang dapat dilakukan untuk mengurangi Tm dari produk PCR yaitu dengan mengganti dGTP dengan 7-deaza-dGTP dalam campuran reaksi.

Tahap Annealing Primer.

Biasanya suhu optimal anealing adalah 5°C lebih rendah dari temperatur melting (Tm) primer-template DNA duplex. Inkubasi selama 0.5-2 menit biasanya sudah cukup. Namun, jika diperoleh produk PCR yang tidak spesifik, maka suhu anealing dapat ditingkatkan pada tahap tersebut 1-2°C.

Tahap Extending.

Biasanya tahap pemanjangan (extending) ini dilakukan pada suhu 70-75°C. Kecepatan sintesis DNA oleh Taq DNA Polymerase pada suhu tersebut sangat tinggi. Periode dari tahap ini yang direkomendasikan adalah 1 menit untuk mensintesis fragmen PCR hingga 2 kb. Apabila fragmen DNA yang lebih besar yang akan diamplifikasi, maka waktu extensinya di tingkatkan menjadi 1 menit tiap 1 kb.

Jumlah Siklus.

Jumlah siklus PCR tergantung dari jumlah template DNA dalam campuran reaksi dan jumlah produk PCR yang diinginkan. Untuk kurang dari 10 salinan dari templet DNA, dapat dilakukan sebanyak 40 siklus. Jika jumlah awal templet DNA cukup tinggi, maka 25-35 siklus sudah cukup.

Tahap Extending Akhir.

Setelah akhir siklus, sampel biasanya di inkubasikan pada suhu 72°C selama 5-15 menit yang bertujuan untuk menyelesaikan penggandaan yang belum selesai dari produk PCR baru. Juga, pada tahapan ini, aktifitas akhir transferasi dari Taq DNA Polymerase akan menambahkan nukleotida A pada ujung 3′ produk PCR. Selanjutnya, jika fragmen PCR ini akan digunakan untuk diklon pada vektor, biasanya diperlukan waktu sekitar 30 menit.

Optimasi Reaksi PCR.

Program PCR asli biasanya menggunakan 1 menit untuk tahap denaturasi dan anealing. Kondisi ini memerlukan waktu yang cukup panjang dibandingkan dengan waktu asli yang diperlukan. Selain itu, jika produk PCR kita kurang dari 1 kb, maka 1 menit merupakan waktu ekstensi yang cukup lama.

Jika memungkinkan, gunakan “PCR 2-langkah”:

1. Denaturasi Awal, 2-3 menit pada suhu 94 C

2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C

3. Anealing dan ekstensi simultan, “x” menit pada suhu 68 C

“x” tergantung pada panjang produk yang diinginkan, 1 menit/kb

4. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.

Jika Tm dari primer yang digunakan kurang dari 65 C, atau PCR 2-langkah ini tidak memberikan hasil yang diinginkan, maka gunakan,

“PCR 3-langkah”:

1. Denaturasi awal, 2-3 menit pada suhu 94 C

2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C

3. Annealing, 15 detik pada suhu “x” C

“x” tergantung pada Tm, biasanya 5 derajat dari Tm Primer terendah

4. Ekstensi, “x” detik

“x” tergantung pada ukuran Produk yang diinginkan, 1 menit/kb

5. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.