cDNA

DNA Komplementer

Pada bidang genetika, complementary DNA (cDNA) merupakan DNA yang disintesis dari template mRNA dalam sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim reverse transcriptase. cDNA biasanya digunakan untuk kloning gen eukariot dalam prokariot. Jika seorang ilmuan ingin mengekspresikan protein tertentu dalam sell yang secara normalnya tidak mengekspresikan protein tersebut (contohnya ekspresi heterolog), mereka akan mentranfer cDNA yang mengkode protein tersebut ke dalam sel donor (sel penerima). cDNA juga diproduksi oleh kelompok retrovirus (seperti HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus, dan lain sebagainya) yang terintegrasi dengan inangnya untuk membuat sebuah provirus (calon virus).

Pendahuluan

Central dogma dari biologi molekular mengatakan bahwa dalam sintesis protein, DNA pertama-tama di transkrip menjadi mRNA yang selanjutnya akan mentranslasikan protein. Satu perbedaan antara gen eukariot dan prokariot adalah adanya intron (intervening sequence) pada gen eukariot, yang juga bukan merupakan sequens penyandi, dan harus dihilangkan (splice) dari RNA sebelum menjadi mRNA dan kemudian dapat ditranslasi menjadi protein. Sedangkan gene prokariot tidak memiliki intron, sehingga RNA bakteri tidak melakukan penghilangan intron (splicing).

Biasanya, keperluan ekpresi gen eukariot dilakukan dalam sel prokariot. Metode yang sangat sederhara untuk melakukan hal ini adalah menambahkan DNA eukariot ke dalam sel donor prokariot, yang kemudian akan mentraskripkan DNA menjadi mRNA dan kemudian mentranslasikan protein. Sayangnya, DNA protein memiliki intron, dan juga sel prokariot tidak memiliki kemampuan untuk melakukan splicing, sehingga untuk melakukan hal ini splicing harus dilakukan sebelum DNA eukariot tersebut dimasukan ke dalam sel prokariot. DNA yang telah dibuat merupakan komplemen dari RNA yang juga disebut complementary DNA (cDNA). Untuk mengekspresikan protein dari cDNA tersebut, maka diperlukan sequence pengatur ekspresi seperti Promotor.

Sintesis

Terdapat beberapa metode yang dapat dilakukan, cDNA harus di sintesis dari mRNA (setelah splicing atau mRNA tanpa Intron) menggunakan enzyme reverse transcriptase. Enzim ini bekerja pada untai tunggal mRNA, menghasilkan DNA komplemen berdasarkan urutan pasang basa RNA (A, U, G dan C) menjadi DNA komplemen (T, A, C dan G berturut-turut).

Untuk mendapatkan cDNA dari sel eukariot yang intronnya telah dihilangkan (spliced) sebagai berikut:

1. Sel eukariot mentranskripkan DNA (dari gen) menjadi RNA (pre-mRNA)
2. Sel yang sama kemudian melakukan proses splicing pada untai pre-mRNA, dan menambahkan ujung poly-A tail dan 5’ Methyl-Guanine cap.
3. Campuran untai mRNA diekstrak dari sel
4. Sebuah primer oligonukleotida poly-T berhibridisasi dengan poly-A tail dari templet mRNA, atau primer hexamer acak dapat ditambahkan yang mana mengandung 6 basa yang paling mungkin ada dalam untai DNA dan dapat berhibridisasi di mana saja dalam RNA (dipelukan reverse transcriptase)
5. Penambahan Reverse transcriptase, dan juga deoxynucleoside triphosphates (A, T, G, C).

Enzim reverse transcriptase akan mengecek mRNA dan mensinstesi sebuah DNA yang merupakan pasangan dari mRNA tersebut. Untaian inilah yang disebut cDNA.

Berikut adalah animasi dari siklus virus HIV yang diantaranya adalah mensintensis cDNA dalam inangnya.