PCR atau Polymerase Chain Reaction
Parameter amplifikasi tergantung pada template, primer dan aparatus amplifikasi yang digunakan..
Tahap Denaturasi Awal
- Denaturasi sempurna template DNA pada permulaan PCR merupakan salah satu hal penentu suksesnya reaksi PCR. Tidak sempurnanya denaturasi DNA menyebabkan penggunaan template yang tidak efisien pada permulaan siklus amplifikasi dan hasil PCR yang kurang baik. Denaturasi awal harus dilakukan sekitar 1-3 menit pada suhu 95°C jika kandungan GC dari DNA target adalah 50% atau less. Interval ini dapat ditingkatkan hingga10 menit jika kandungan GC dari DNA templet sangat tinggi.
- Jika denaturasi awal kurang dari 3 menit pada suhu 95°C, Taq DNA Polymerase dapat ditambahkan pada campuran saat reaksi awal. Jika waktu denaturasi awal yang diperlukan sangat lama atau suhu yang digunakan sangat tinggi, maka Taq DNA Polymerase harus ditambahkan setelah denaturasi awal untuk menjaga stabilitas enzim yang secara drastis turun pada suhu lebih dari 95°C.
Tahap Denaturasi.
Biasanya denaturasi selama 0.5 – 2 menit pada suhu 94-95°C sudah cukup baik, ketika produk PCR yang disintesis pada siklus amplifikasi awal cukup pendek dari pada templet DNA dan telah terdenaturasi secara sempurna pada kondisi tersebut. Jika DNA yang diamplifikasi memiliki kandungan GC yang cukup tinggi, waktu denaturasi sebaiknya ditingkatkan mecapai 3-4 menit. Selain itu penambahan bahan untuk membantu proses denaturasi dapat dilakukan misalnya dengan gliserol (hingga 10-15 %), DMSO (hingga 10%) atau formamid (hingga 5%). Dengan adanya bahan tersebut, temperatur anealing harus diatur secara experimental, mengingat Tm dari primer-templat menurun secara signifikan ketika bahan-bahan tersebut digunakan. Jumlah enzim dalam reaksi harus ditingkatkan hingga 50%, mengingat DMSO dan formamid, pada konsentrasi tersebut menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase. Selain itu, ada cara umum yang dapat dilakukan untuk mengurangi Tm dari produk PCR yaitu dengan mengganti dGTP dengan 7-deaza-dGTP dalam campuran reaksi.
Tahap Annealing Primer.
Biasanya suhu optimal anealing adalah 5°C lebih rendah dari temperatur melting (Tm) primer-template DNA duplex. Inkubasi selama 0.5-2 menit biasanya sudah cukup. Namun, jika diperoleh produk PCR yang tidak spesifik, maka suhu anealing dapat ditingkatkan pada tahap tersebut 1-2°C.
Tahap Extending.
Biasanya tahap pemanjangan (extending) ini dilakukan pada suhu 70-75°C. Kecepatan sintesis DNA oleh Taq DNA Polymerase pada suhu tersebut sangat tinggi. Periode dari tahap ini yang direkomendasikan adalah 1 menit untuk mensintesis fragmen PCR hingga 2 kb. Apabila fragmen DNA yang lebih besar yang akan diamplifikasi, maka waktu extensinya di tingkatkan menjadi 1 menit tiap 1 kb.
Jumlah Siklus.
Jumlah siklus PCR tergantung dari jumlah template DNA dalam campuran reaksi dan jumlah produk PCR yang diinginkan. Untuk kurang dari 10 salinan dari templet DNA, dapat dilakukan sebanyak 40 siklus. Jika jumlah awal templet DNA cukup tinggi, maka 25-35 siklus sudah cukup.
Tahap Extending Akhir.
Setelah akhir siklus, sampel biasanya di inkubasikan pada suhu 72°C selama 5-15 menit yang bertujuan untuk menyelesaikan penggandaan yang belum selesai dari produk PCR baru. Juga, pada tahapan ini, aktifitas akhir transferasi dari Taq DNA Polymerase akan menambahkan nukleotida A pada ujung 3′ produk PCR. Selanjutnya, jika fragmen PCR ini akan digunakan untuk diklon pada vektor, biasanya diperlukan waktu sekitar 30 menit.
Optimasi Reaksi PCR.
Program PCR asli biasanya menggunakan 1 menit untuk tahap denaturasi dan anealing. Kondisi ini memerlukan waktu yang cukup panjang dibandingkan dengan waktu asli yang diperlukan. Selain itu, jika produk PCR kita kurang dari 1 kb, maka 1 menit merupakan waktu ekstensi yang cukup lama.
Jika memungkinkan, gunakan “PCR 2-langkah”:
1. Denaturasi Awal, 2-3 menit pada suhu 94 C
2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C
3. Anealing dan ekstensi simultan, “x” menit pada suhu 68 C
“x” tergantung pada panjang produk yang diinginkan, 1 menit/kb
4. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.
Jika Tm dari primer yang digunakan kurang dari 65 C, atau PCR 2-langkah ini tidak memberikan hasil yang diinginkan, maka gunakan,
“PCR 3-langkah”:
1. Denaturasi awal, 2-3 menit pada suhu 94 C
2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C
3. Annealing, 15 detik pada suhu “x” C
“x” tergantung pada Tm, biasanya 5 derajat dari Tm Primer terendah
4. Ekstensi, “x” detik
“x” tergantung pada ukuran Produk yang diinginkan, 1 menit/kb
5. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.
Addy
