Dalam Central dogma dikatakan bahwa informasi biologi bermula dari DNA ke RNA kemudian ke protein (Gambar 1). Namun, ada juga informasi yang berasal dari RNA ke DNA seperti contohnya pada virus HIV yang hanya memiliki RNA genom yang harus dikonversi dulu menjadi DNA. Untuk mengkonversi RNA menjadi DNA, maka diperlukan enzim yang dikenal dengan reverse transkriptase yang diketahui juga di miliki oleh virus tersebut. Pakar biologi molekular juga berhasil memanfaatkan enzim tersebut, reverse transcriptase, untuk mengkonversi mRNA menjadi complementary DNA (DNA komplementer) yang lebih dikenal dengan cDNA.
Gambar 1. Central dogma: DNA menjadi RNA menjadi mRNA menjadi Protein.
Menggunakan cDNA dalam beberapa kegiatan molekular cenderung lebih aman dibandingkan RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarena kestabilan dari RNA itu sendiri yang mudah sekali terdegradasi oleh RNase. Sehingga untuk berkerja dengan RNA secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi. Oleh karena itu, cara yang dianggap paling efektif dan efisien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya dalam prosesnya menghasilkan cDNA. Begitupula, penyelidikan dengan DNA Microarray juga mengkonversi mRNA menjadi cDNA untuk memproduksi probesnya.
Secara deskripsi, cDNA merupakan untai ganda DNA yang dibuat dari mRNA baik berasal dari prokariot maupun eukariot. Ketika mRNA berhasil diisolasi, maka diperlukan beberapa reagent yang sangat penting dalam proses konversi tersebut yaitu dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase. Selanjutnya yang harus dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan campuran reagen tersebut untuk membuat untai komplemen dari DNA (sintesis untai pertama). Proses ini memakan waktu 10-60 menit tergantung enzim reverse transkriptase yang digunakan. Kemudian mRNA harus dihilangkan dan untai kedua DNA dapat disentesis. Secara umum proses tersebut digambarkan sebagai berikut.
Figure 2. Empat jenis reagen Dasar yang diperlukan untu menghasilkan cDNA: mRNA sebagai cetakan, dNTP, enzim reverse transcriptase dan primer
1. mRNA
mRNA atau yang dikenal dengan messenger RNA merupakan untai tunggal yang membawa kode genetik yang siap untuk ditranslasikan di ribosom menjadi sebuah atau beberapa protein tertentu. Perlu diketahui bahwa tidak semua RNA bisa langsung digunakan sebagai template untuk dibuat sebagai cDNA kaitannya untuk mempelajari ekspresi suatu gen. Sebut saja RNA yang disandikan oleh kelompok eukariot dimana RNA tersebut masih mengandung sekuens asam nukleat yang tidak menyandikan protein tertentu atau yang dikenal dengan intron. Oleh sebab itu intron tersebut perlu dihilangkan sebelum digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA. Sebaliknya sebagian besar RNA dari prokariot bisa langsung digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA karena tidak memiliki intron.
2. dNTPs
dNTPs atau kependekan dari deoksi nucleotida triphosphate merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin dan Timin). Bahan ini sangat penting untuk kelanjutan sintesis cDNA dari mRNA. Tanpa adanya dNTPs maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskri balik dengan bantuan enzim reverse transkriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerisasi menjadi untai cDNA.
3. Enzim Reverse Transcriptase
Enzim reverse transkriptase merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Di alam, banyak sekali jenis enzim ini yang secara umum dimiliki oleh virus-virus yang memiliki asam nukleat berupa RNA seperti HIV. Adapun enzim reverse transkriptase yang banyak digunakan untuk membuat cDNA di antaranya adalah M-MLV reverse transkriptase dari Moloney murine leukemia virus dan AMV reverse transkriptase dari avian myeloblastosis virus. Enzim ini akan bekerja dari ujung 3′ ke ujung 5′ dari mRNA.
4. Primer.
Terdapat tiga jenis primer yang dapat digunakan untuk mensintesis cDNA. 1) Jika mRNA memiliki poly-A pada ujung 3′, maka primer oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukariot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3′ setelah proses splicing untuk menghilangkan intron.
2) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari mRNA tertentu (mRNA target) maka penggunaan primer spesifik dapat dilakukan. Primer jenis umumnya digunakan pada mRNA dari sel prokariot karena mRNA dari sel prokariot tidak mengandung poly-A (sel tidak melakukan poly adenilasi.
3) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari seluruh mRNA secara acak, maka random primer dapat digunakan.
Namun, pemilihan primer secara umum adalah tergantung pada jenis kebutuhan dan target mRNA yang digunakan.
Addy
