ESI-MS (ELECTROSPRAY IONIZATION-MASS SPECTROMETRY)

Electrospray ionization (ESI) merupakan teknik yang digunakan dalam mass spectrometri untuk menghasilkan ion. Khususnya untuk menghasilkan ion dari makromolekul karena ada kecenderungan molekul tersebut menjadi fragment saat diionisasi. Pengembangan electrospray ionization untuk analisa makromolekul biologi merupakan sebuah kerja keras jadi John Bennet Fenn pada tahun 2002 dan memperoleh sebuah Nobel dibidang Kimia. Satu dari instrumen asli yang digunakan oleh Dr. Fenn saat ini di pajang di Chemical Heritage Foundation in Philadelphia, Pennsylvania.

Mass spectrometry yang menggunakan teknologi ESI disebut dengan electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) atau juga dengan sebutan electrospray mass spectrometry (ES-MS).

Teori dan Sejarah
Fenomena electrospray telah diketahui ratusan tahun yang lalu, tapi hingga permulaan abad ke 20, masih belum ada pengetahuan yang signifikan tentang fenomena ini. Hingga pada 30 tahun yang lalu, percobaan yang dilakukan oleh Malcom Dole dan kawan-kawan berhasil mendemonstrasikan penggunaan electrospray untuk mengioninasi senyawa kimia hingga dan teknik electrospray ionisation (ESI) inipun ditemukan. 20 tahun berlalu hingga pada akhirnya Laboratorium dimana John Fenn bekerja, berhasil mendemonstrasikan untuk pertama kalinya penggunaan ESI untuk ionisasi senyawa biologi dan analisanya dengan mass spectrometri. Hasil upaya ini membuahkan hasil sebuah Nobel pada tahun 2002 dibidang kimia yang juga merupakan Nobel ke-4 yang diberikan atas upaya pengembangan dibidang mass spectrometri. Pada publikasi asil sekitar akhir 1980-an, Fenn dan teman-temanya berhasil mendemonstrasikan prinsip dan metodologi eksperimen dasar dari teknik ESI yang meliputi soft ionisation dari senyawa involatil dan termolabil, protein dengan banyak muatan ionisasi kompleks. ESI-MS saat ini merupakan alat dasat yang dingunakan hampir di seluruh laboratorium biokimia di dunia.

Gambar 1. ESI

Alat ESI terus dikembangkankan tapi secara umum susunan dari komponen dasarnya sama (Gambar). Analit dimasukan dalam larutan dari jarum pompa atau aliran eluen dari liquid chromatography. Kecepatan aliran yang biasa digunakan adalah 1µl min^-1. Selanjutnya analit mengalir melewati jarum electrospray yang memiliki tegangan tinggi yang berbeda (berasal dari counter electrode) (biasanya berkisar 2.5 sampai 4 kV). Ini meningkatkan semprotan dari tetesan sampel yang bermuatan ion dari jarum pada permukaan yang juga bermuatan dan berpolaritas sama dengan muatan pada jarum. Tetesan dikeluarkan dari jarum menuju alat sumber sampel yang berupa kerucut pada kotak elektroda (Warna biru). Selanjutnya tetesan sampel tersebut akan melewati ruang di antara jarum dan kerucut dan selanjutnya pelarut sampel akan terevaporasi.

Gambar. 2: Skema ESI

Ketika solvent (pelarut) terevaporasi, maka tetesan akan menguap hingga batas tegangan permukaan (the Rayleigh limit) dimana “Coulombic explosion” terjadi dan tetesan menjadi bagian-bagian (serpihan). Hal ini akan menghasilkan tetesan-tetesan kecil yang dapat diulang terus menerus hingga menghasilkan analit (tanpa pelarut) yang telah bermuatan ion. Molekul yang bermuatan ini dapat berupa molekul yang bermuatan ion tunggal ataupun bermuatan ion lebih dari satu. Cara ini merupakan metode paling murni dalam ionisasi dimana sangat kecil sekali residu energi yang tersisa dari analit ketika ionisasi. Oleh karena itu mengapa ESI-MS merupakan teknik penting dalam kajian biologis dimana analit yang diperlukan biasanya berupa molekul-protein non-kovalen atau protein-protein interaction secara tidak langsung ditransfer ke fase gas. Kelemahan utama dari teknik ini adalah sangat kecilnya (biasanya tidak ada) terjadinya fermentasi.

Gambar 3. Skema pembentukan ion pada analit dengan ESI-MS

Satu dari permasalahan utama pada analisa protein dengan mass spectal (and makromolekul lainnya) dan selalu muncul adalah massa yang berada diluar range massa mass spektrometer pada umumnya. Sebelum dikembangkan ESI, hanya ada satu cara metode ionisasi yang dilakukan yaitu dengan melakukan analisa sampel dengan fast atom bombardment (FAB). Tapi teknik ini menghasilkan predominansi dari muatan ion tunggal dan yang paling baik adalah beberapa muatan ion pada kisaran instrumen yang mencapai m/z 8 kDa. Hanya cara tersebut yang dapat dilakukan untuk mendigesti protein dan menganalisa campuran tersebut. Meskipun digesti protein masih merupakan teknik yang penting dalam mass spektrometri, hal ini menjadi relatif lebih mudah untuk mendapatkan secara langsung mass protein yang akan diukur dengan ESI-MS. Muatan beberapa ion secara statistik terdistribusi pada sisi-sisi dasar protein. Gambar berikut menunjukkan karakteristik analisa dengan ESI mass spectrum pada sampel myoglobin hati kuda (16.9 kDa). Puncak teramanai merupakan hasil adanya pengaruh dari muatan-muatan ion, pada kasus ini muatan adalah roughly Gaussian yang terdistribusi rata-rata +15 muatan dengan kisaran +22 hingga +10. Distribusi aktual dari muatan ion ini tergantung pada sejumlah faktor, tapi umumnya kondisi elektrospray memiliki pengaruh yang sangat besar pada distribusi muatan ion sebagaimana halnya struktur dari protein.

Sebuah tutorial yang cukup baik pada aplikasi ESIMS untuk ilmu biologi dan biokimia telah dipublikasikan oleh Komunitas Biokimia. Sedangkan untuk level tinggi (Graduate Student) dipublikasi oleh Simon Gaskell pada tahun 1997.

Daftar Pustaka

[1] S. Chapman; Physical Review, 10; 1937; p184.

[2] M. Dole et al.; Journal of Chemical Physics, 49; 1968, p2240 and Journal of Chemical Physics, 50; 1970, p4977.

[3] J.B. Fenn et al.; Journal of Physical Chemistry, 88; 1984, p4451 and Zeitschrift für Physik D, 10; 1988, p361 and Science, 246; 1989, p64.

[4] J.B. Fenn; Agewandte Chemie – International Edition, 42; 2003, p3871.

[5] B.N.Pramanik, A.K. Ganguly and M.L. Gross; Applied Electrospray Mass Spectrometry – Volume 32 of the Practical Spectroscopy Series. Pub. Marcel Dekker, New York, 2002, ISBN: 0-8274-0618-8.

[6]W. J. Griffiths et al.; Biochemical Journal, 355; 2001, p545.

[7] S.J.Gaskell; Journal of Mass Spectrometry, 32, 1997, p677.

cDNA

DNA Komplementer

Pada bidang genetika, complementary DNA (cDNA) merupakan DNA yang disintesis dari template mRNA dalam sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim reverse transcriptase. cDNA biasanya digunakan untuk kloning gen eukariot dalam prokariot. Jika seorang ilmuan ingin mengekspresikan protein tertentu dalam sell yang secara normalnya tidak mengekspresikan protein tersebut (contohnya ekspresi heterolog), mereka akan mentranfer cDNA yang mengkode protein tersebut ke dalam sel donor (sel penerima). cDNA juga diproduksi oleh kelompok retrovirus (seperti HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus, dan lain sebagainya) yang terintegrasi dengan inangnya untuk membuat sebuah provirus (calon virus).

Pendahuluan

Central dogma dari biologi molekular mengatakan bahwa dalam sintesis protein, DNA pertama-tama di transkrip menjadi mRNA yang selanjutnya akan mentranslasikan protein. Satu perbedaan antara gen eukariot dan prokariot adalah adanya intron (intervening sequence) pada gen eukariot, yang juga bukan merupakan sequens penyandi, dan harus dihilangkan (splice) dari RNA sebelum menjadi mRNA dan kemudian dapat ditranslasi menjadi protein. Sedangkan gene prokariot tidak memiliki intron, sehingga RNA bakteri tidak melakukan penghilangan intron (splicing).

Biasanya, keperluan ekpresi gen eukariot dilakukan dalam sel prokariot. Metode yang sangat sederhara untuk melakukan hal ini adalah menambahkan DNA eukariot ke dalam sel donor prokariot, yang kemudian akan mentraskripkan DNA menjadi mRNA dan kemudian mentranslasikan protein. Sayangnya, DNA protein memiliki intron, dan juga sel prokariot tidak memiliki kemampuan untuk melakukan splicing, sehingga untuk melakukan hal ini splicing harus dilakukan sebelum DNA eukariot tersebut dimasukan ke dalam sel prokariot. DNA yang telah dibuat merupakan komplemen dari RNA yang juga disebut complementary DNA (cDNA). Untuk mengekspresikan protein dari cDNA tersebut, maka diperlukan sequence pengatur ekspresi seperti Promotor.

Sintesis

Terdapat beberapa metode yang dapat dilakukan, cDNA harus di sintesis dari mRNA (setelah splicing atau mRNA tanpa Intron) menggunakan enzyme reverse transcriptase. Enzim ini bekerja pada untai tunggal mRNA, menghasilkan DNA komplemen berdasarkan urutan pasang basa RNA (A, U, G dan C) menjadi DNA komplemen (T, A, C dan G berturut-turut).

Untuk mendapatkan cDNA dari sel eukariot yang intronnya telah dihilangkan (spliced) sebagai berikut:

1. Sel eukariot mentranskripkan DNA (dari gen) menjadi RNA (pre-mRNA)
2. Sel yang sama kemudian melakukan proses splicing pada untai pre-mRNA, dan menambahkan ujung poly-A tail dan 5’ Methyl-Guanine cap.
3. Campuran untai mRNA diekstrak dari sel
4. Sebuah primer oligonukleotida poly-T berhibridisasi dengan poly-A tail dari templet mRNA, atau primer hexamer acak dapat ditambahkan yang mana mengandung 6 basa yang paling mungkin ada dalam untai DNA dan dapat berhibridisasi di mana saja dalam RNA (dipelukan reverse transcriptase)
5. Penambahan Reverse transcriptase, dan juga deoxynucleoside triphosphates (A, T, G, C).

Enzim reverse transcriptase akan mengecek mRNA dan mensinstesi sebuah DNA yang merupakan pasangan dari mRNA tersebut. Untaian inilah yang disebut cDNA.

Berikut adalah animasi dari siklus virus HIV yang diantaranya adalah mensintensis cDNA dalam inangnya.

SIKLUS PCR

PCR atau Polymerase Chain Reaction

Parameter amplifikasi tergantung pada template, primer dan aparatus amplifikasi yang digunakan..

Tahap Denaturasi Awal

• Denaturasi sempurna template DNA pada permulaan PCR merupakan salah satu hal penentu suksesnya reaksi PCR. Tidak sempurnanya denaturasi DNA menyebabkan penggunaan template yang tidak efisien pada permulaan siklus amplifikasi dan hasil PCR yang kurang baik. Denaturasi awal harus dilakukan sekitar 1-3 menit pada suhu 95°C jika kandungan GC dari DNA target adalah 50% atau less. Interval ini dapat ditingkatkan hingga10 menit jika kandungan GC dari DNA templet sangat tinggi.
• Jika denaturasi awal kurang dari 3 menit pada suhu 95°C, Taq DNA Polymerase dapat ditambahkan pada campuran saat reaksi awal. Jika waktu denaturasi awal yang diperlukan sangat lama atau suhu yang digunakan sangat tinggi, maka Taq DNA Polymerase harus ditambahkan setelah denaturasi awal untuk menjaga stabilitas enzim yang secara drastis turun pada suhu lebih dari 95°C.

Tahap Denaturasi.

Biasanya denaturasi selama 0.5 – 2 menit pada suhu 94-95°C sudah cukup baik, ketika produk PCR yang disintesis pada siklus amplifikasi awal cukup pendek dari pada templet DNA dan telah terdenaturasi secara sempurna pada kondisi tersebut. Jika DNA yang diamplifikasi memiliki kandungan GC yang cukup tinggi, waktu denaturasi sebaiknya ditingkatkan mecapai 3-4 menit. Selain itu penambahan bahan untuk membantu proses denaturasi dapat dilakukan misalnya dengan gliserol (hingga 10-15 %), DMSO (hingga 10%) atau formamid (hingga 5%). Dengan adanya bahan tersebut, temperatur anealing harus diatur secara experimental, mengingat Tm dari primer-templat menurun secara signifikan ketika bahan-bahan tersebut digunakan. Jumlah enzim dalam reaksi harus ditingkatkan hingga 50%, mengingat DMSO dan formamid, pada konsentrasi tersebut menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase. Selain itu, ada cara umum yang dapat dilakukan untuk mengurangi Tm dari produk PCR yaitu dengan mengganti dGTP dengan 7-deaza-dGTP dalam campuran reaksi.

Tahap Annealing Primer.

Biasanya suhu optimal anealing adalah 5°C lebih rendah dari temperatur melting (Tm) primer-template DNA duplex. Inkubasi selama 0.5-2 menit biasanya sudah cukup. Namun, jika diperoleh produk PCR yang tidak spesifik, maka suhu anealing dapat ditingkatkan pada tahap tersebut 1-2°C.

Tahap Extending.

Biasanya tahap pemanjangan (extending) ini dilakukan pada suhu 70-75°C. Kecepatan sintesis DNA oleh Taq DNA Polymerase pada suhu tersebut sangat tinggi. Periode dari tahap ini yang direkomendasikan adalah 1 menit untuk mensintesis fragmen PCR hingga 2 kb. Apabila fragmen DNA yang lebih besar yang akan diamplifikasi, maka waktu extensinya di tingkatkan menjadi 1 menit tiap 1 kb.

Jumlah Siklus.

Jumlah siklus PCR tergantung dari jumlah template DNA dalam campuran reaksi dan jumlah produk PCR yang diinginkan. Untuk kurang dari 10 salinan dari templet DNA, dapat dilakukan sebanyak 40 siklus. Jika jumlah awal templet DNA cukup tinggi, maka 25-35 siklus sudah cukup.

Tahap Extending Akhir.

Setelah akhir siklus, sampel biasanya di inkubasikan pada suhu 72°C selama 5-15 menit yang bertujuan untuk menyelesaikan penggandaan yang belum selesai dari produk PCR baru. Juga, pada tahapan ini, aktifitas akhir transferasi dari Taq DNA Polymerase akan menambahkan nukleotida A pada ujung 3′ produk PCR. Selanjutnya, jika fragmen PCR ini akan digunakan untuk diklon pada vektor, biasanya diperlukan waktu sekitar 30 menit.

Optimasi Reaksi PCR.

Program PCR asli biasanya menggunakan 1 menit untuk tahap denaturasi dan anealing. Kondisi ini memerlukan waktu yang cukup panjang dibandingkan dengan waktu asli yang diperlukan. Selain itu, jika produk PCR kita kurang dari 1 kb, maka 1 menit merupakan waktu ekstensi yang cukup lama.

Jika memungkinkan, gunakan “PCR 2-langkah”:

1. Denaturasi Awal, 2-3 menit pada suhu 94 C

2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C

3. Anealing dan ekstensi simultan, “x” menit pada suhu 68 C

“x” tergantung pada panjang produk yang diinginkan, 1 menit/kb

4. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.

Jika Tm dari primer yang digunakan kurang dari 65 C, atau PCR 2-langkah ini tidak memberikan hasil yang diinginkan, maka gunakan,

“PCR 3-langkah”:

1. Denaturasi awal, 2-3 menit pada suhu 94 C

2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C

3. Annealing, 15 detik pada suhu “x” C

“x” tergantung pada Tm, biasanya 5 derajat dari Tm Primer terendah

4. Ekstensi, “x” detik

“x” tergantung pada ukuran Produk yang diinginkan, 1 menit/kb

5. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.

SDS-PAGE

SDS-PAGE atau  kependekan dari Sodium Dedocyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis, merupakan sebuah teknik dalam bidang biologi molekular yang banyak digunakan dalam bidang biokimia, forensik dan genetik untuk memisahkan protein berdasarkan mobilitas elektroporetiknya. Gel  SDS akan memelektroforesis sampel protein yang memiliki kesamaan muatan elektron per unit massa akibat mengikatnya SDS yang menghasilkan fragmen-fragmen protein sesuai dengan ukuran molekul proteinnya.

Prosedur

Pertama-tama, larutan protein yang akan dianasila dicampur dengan SDS, sebuah deterjen anionik yang mendenaturasi menjadi struktur sekunder dan mengikat pada struktur tersier protein, yang selanjutnya mengubah struktur protein menjadi bermuatan negatif. Tanpa SDS, protein yang berbeda dengan berat molekul yang sama akan berbeda jarak migrasinya akibat perbedaan rasio muatan massanya, sebab setiap protein memiliki bagian isoelektrik dan berat molekul khusus pada struktur primernya yang dikenal dengan NATIVE PAGE. Penambahan SDS akan mengatasi permasalahan tersebut dengan mengikat dan membuka struktur protein menjadi bentuk terdenaturasi yang bermuatan negatif pada seluruh permukaan untai polipeptida.

SDS megikat pada rasio sekitar 1.4 g SDS per 1.0 g protein (meskipun rasio pengikatan dapat bervariasi dari 1.1-2.2 g SDS/g protein), yang selanjutnya jarak migrasi pada gel dapat diasumsikan secara langsung dengan ukuran protein. Dye pelacak dapat ditambahkan pada sampel protein (yang ukurannya lebih kecil dari ukuran protein) untuk mempermudah pelacakan migrasi sampel protein pada gel saat migrasi.

BIOLOGI MOLEKULAR

Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.

Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman untuk menghasilkan varietas-varietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi hewan. Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan vaksin, antibiotik, dan insulin walaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses fermentasi yang tidak sempurna. Perubahan signifikan terjadi setelah penemuan bioreaktor oleh Louis Pasteur. Dengan alat ini, produksi antibiotik maupun vaksin dapat dilakukan secara massal.

Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun AIDS. Penelitian di bidang pengembangan sel induk juga memungkinkan para penderita stroke ataupun penyakit lain yang mengakibatkan kehilangan atau kerusakan pada jaringan tubuh dapat sembuh seperti sediakala. Di bidang pangan, dengan menggunakan teknologi rekayasa genetika, kultur jaringan dan rekombinan DNA, dapat dihasilkan tanaman dengan sifat dan produk unggul karena mengandung zat gizi yang lebih jika dibandingkan tanaman biasa, serta juga lebih tahan terhadap hama maupun tekanan lingkungan. Penerapan bioteknologi di masa ini juga dapat dijumpai pada pelestarian lingkungan hidup dari polusi. Sebagai contoh, pada penguraian minyak bumi yang tertumpah ke laut oleh bakteri, dan penguraian zat-zat yang bersifat toksik (racun) di sungai atau laut dengan menggunakan bakteri jenis baru.

Kemajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.

ETHIDUM BROMIDA DAN ASAM NULEAT

Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada DNA. Etidium juga biasa digunakan dalam biokimia untuk memvisualisasi potong-potongan DNA yang telah di pisahkan pada gel elektroforesis. Molekul etidium berpendar fluor ketika diiluminasi dengan cahaya ultraviolet (UV) pada kisaran visible UV. Berikut ini merupakan gambar dari potongan hasil iluminasi setelah etidium mengikat pada DNA.

Etidium mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada untai ganda DNA. Perlu diketahui bahwa struktur cincin etidium adalah hidrofobik dan mirip dengan struktur cincin pada DNA. Etidium dapat membentuk kontak van der Walls tertutup dengan pasangan basa dan hal ini merupakan jawaban bahwa mengapa etidium mengikat pada lokasi hidrofobik molekul DNA

Molekul yang mengikat pada lokasi tersebut dikenal dengan Agent inter khelat karena mengkhelat pada susunan DNA yang kokoh. Dengan demikian, etidium merusak pilin ganda (double helix) dan menghambat replikasi DNA transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi. Ini sebabnya intercalating agent berpotensi sebagai mutagen

Gambar di atas menunjukkan terjadinya gangguan pada struktur rangka Gula-Fosfat DNA ketika agent inter-khelat ini mengikat dan ini juga menunjukkan bahwa terjadinya perpanjangan DNA.

Perubahan ini perlu sekali untuk diperhatikan. Satu cara dalam pemisahan molekul DNA sirkular tertutup “closed circular DNA’s molecules” dari potongan linier adalah dengan perlakuan etidium bromida. Agent inter-khelat tidak mengikat pada DNA sirkuler tertutup sebab DNA tersebut tidak dapat memanjang lagi dan tidak memungkinkan untuk disisipi dengan partikel tertentu.

Normal plasmid DNA sirkuler dapat dipisahkan dari DNA linier dengan mengikatkan pada etidium karena mengikatnya etidium mengubah keseluruhan kerapatan DNA.

---

Daftar Pustaka

 

Moran,L., Mirault, M-E., Tissières, A., Lis, J., Schedl, P., Artavanis-Tsakonas, S., and Gehring, W. (1979) Physical Map of Two D. melanogaster DNA Segments Containing Sequences Coding for the 70,000 Dalton Heat Shock Protein. Cell 17:1-8.

Reha, D., Kabelác, M., Ryjácek, F., Sponer, J., Sponer, J.E., Elstner, M., Suhai, S., and Hobza, P. (2003) Intercalators. 1. Nature of stacking interactions between intercalators (ethidium, daunomycin, ellipticine, and 4′,6-diaminide-2-phenylindole) and DNA base pairs. Ab initio quantum chemical, density functional theory, and empirical potential study. J. Am. Chem. Soc. 124:3366-76.